蛋白質(zhì)免疫印跡(WB )常見問題

蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB )是很常規(guī)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

聽起來不錯，不過真正在實(shí)驗(yàn)室里做實(shí)驗(yàn)的小伙伴恐怕都遇到過各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完美的狀況，做了很久的WB，走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結(jié)WB實(shí)驗(yàn)中可能會遇到的問題，分析可能的原因及對應(yīng)的解決方案，這就是實(shí)驗(yàn)成功的基石。我們列舉一些常見問題來進(jìn)行分析。

如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。

①二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；

②ECL底物中H2O2不穩(wěn)定，失活；

③ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；

④一抗選擇不當(dāng)；

⑤二抗失活。

2、背景高咋回事？

可能的原因有：

●完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜；

●洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數(shù)；

●電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調(diào)整電極和加樣；

●封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜；

●封閉物使用不當(dāng)，比如檢測生物素標(biāo)記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉；

●封閉時間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過夜；

①抗體非特異性結(jié)合，可以降低抗體濃度，減少孵育時間

②一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進(jìn)行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度

③一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結(jié)合過夜

④抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時間

⑤化學(xué)顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物

3、為啥條帶形狀不好看？

可能的原因有：

①膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻

②某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致

③緩沖液陳舊，成分改變,可以重配

④凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走

⑤電泳時溫度過高，可以降低電流或電壓

⑥樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分?jǐn)嚢杌靹?/span>

4、蛋白條帶位置（大小）不對咋整？   

可能的原因有：

①膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度

②抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時間

③酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

④目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定

⑤標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽性對照比對結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量

5、有很多雜帶咋回事？   

可能的原因有：

①目的蛋白有多個修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小

②樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作

③雜蛋白多，建議處理目的蛋白

④抗體特異性不強(qiáng)，建議使用特異性強(qiáng)的抗體

⑤抗體孵育時間過久，建議減少抗體孵育時間

⑥二抗與抗原有交叉反應(yīng)，建議選擇合適的封閉物

⑦二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度

⑧底物顯色與曝光時間過長，建議縮短顯色及曝光的時間

6、背景有黑色斑點(diǎn)或有不均勻的白色斑點(diǎn)以及暗背景上白色帶 

可能的原因有：

①抗體與封閉試劑反應(yīng)，建議使用前過濾封閉試劑

②HRP含量過高，建議降低酶聯(lián)二抗的濃度

③HRP偶聯(lián)二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體

④抗體分布不均勻，建議孵育抗體時使用搖床

7、細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB？

一般5×10^6就足夠。

8、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？

可能的原因有：

①細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；

②抗體不能識別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題；

③可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時間過長；

④細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性。

9、我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？

①可以加大抗原上樣量，這是主要的；

②也可以將一抗稀釋比例降低；

③還可以延長曝光時間。

10、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD），請問怎么做WB？

①可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；

②也可以選擇PSQ 膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。

11、大分子量蛋白200KD，在做WB要注意什么？

①做200kd蛋白的WB時要注意，分離膠選擇>7%的；剝膠時要小心；

②轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）；

③轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高!